Создание генной инженерии. Чем занимается генная-инженерия

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма . В отличие от традиционной селекции , в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования . Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Проводятся первые эксперименты по использованию бактерий с перестроенной ДНК для лечения больных .

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии .

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы , способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы , использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы , термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

Другое направление исследований - удаление из ДНК генов, ненужных для кодирования белков и функционирования организмов и создание на основе таких ДНК искусственных организмов с "усеченным набором" генов. Это позволяет резко повысить устойчивость модифицируемых организмов к вирусам .

История развития и методы

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии . Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Фредериком Сенгером и американским учёным Уолтером Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 года). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Все методы генетической инженерии (англ. Genetic engineering techniques ) применяются для осуществления одного из следующих этапов решения генно-инженерной задачи:

Получение изолированного гена.
Введение гена в вектор для переноса в организм.
Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
Преобразование клеток организма.
Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО ) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию . Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды . Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага , в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации . В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами . Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция .

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование , то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем . В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR /Cas9 .

В конце 2018 года в Китае родились двое детей , геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми . Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома. В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента . Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован .

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия основана на культивировании растительных и животных клеток и тканей, способных вне организма производить нужные для человека вещества. Этот метод используется для клонального (бесполого) размножения ценных форм растений; для получения гибридных клеток, совмещающих свойства, например, лимфоцитов крови и опухолевых клеток, что позволяет быстро получить антитела.

Генетическая инженерия в России

Отмечается, что после введения государственной регистрации ГМО заметно возросла активность некоторых общественных организаций и отдельных депутатов Государственной думы, пытающихся воспрепятствовать внедрению инновационных биотехнологий в российское сельское хозяйство. Более 350 российских ученых подписали открытое письмо Общества научных работников в поддержку развития генной инженерии в Российской Федерации. В открытом письме отмечается, что запрет ГМО в России нанесёт не только ущерб здоровой конкуренции на рынке сельскохозяйственной продукции, но приведёт к значительному отставанию в сфере технологий производства пищевых продуктов, усилению зависимости от импорта продуктов питания, и подорвет престиж России, как государства, в котором официально заявлен курс на инновационное развитие [значимость факта? ] .

См. также

Примечания

Александр Панчин Обыгрывая бога // Популярная механика . - 2017. - № 3. - С. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
Майкл Вальдхольц Трансформеры // В мире науки . - 2017. - № 5-6. - С. 126 - 135.
In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system (англ.) . Nature . Дата обращения 10 января 2017.
Элементы - новости науки: Обезьян вылечили от дальтонизма при помощи генной терапии (неопр.) (18 сентября 2009). Дата обращения 10 января 2017.
Трансгенные обезьяны дали первое потомство (неопр.) . membrana (29 мая 2009). Дата обращения 10 января 2017.
Genetically altered babies born (неопр.) . Би-би-си . Дата обращения 26 апреля 2008. Архивировано 22 августа 2011 года.
B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, 2008. «Molecular biology of the cell», 5th ed., Garland Science, USA, pp. 1302-1303
Kimmelman J. (2009) «Ethics of cancer gene transfer clinical research», Methods in Molecular Biology 542, 423-445
Wagner AM, Schoeberlein A, Surbek D. (2009) «Fetal gene therapy: opportunities and risks», Advanced Drug Delivery Reviews 61, 813-821
Gatzidou E, Gatzidou G, Theocharis SE. (2009) «Genetically transformed world records: a reality or in the sphere of fantasy?», Medical Science Monitor 15, RA41-47
Lowenstein PR. (2008) «Clinical trials in gene therapy: ethics of informed consent and the future of experimental medicine», Current Opinion in Molecular Therapy 10, 428-430
Jin X, Yang YD, Li YM. (2008) «Gene therapy: regulations, ethics and its practicalities in liver disease», World Journal of Gastroenterology 14, 2303-2307

Министерство Сельского Хозяйства Российской Федерации

ФГОУ ВПО «Уральская Государственная сельскохозяйственная Академия»

по дисциплине «Ветеринарная генетика»

на тему: «Генная инженерия – настоящее и будущее»

Выполнила:

Студентка ФВМ

2 курс 2 группа 3 п/группа

Шмакова Т.С.

Проверила:

Ерофеева Л.Ф.

Екатеринбург 2008

Введение

1. Методы генной инженерии

2. Достижения генной инженерии

3. Генная инженерия: за и против

4. Перспективы генной инженерии

Список использованной литературы

Введение

Генная инженерия – совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. Самым ярким событием, привлёкшим наибольшее внимание и очень важным по своим последствиям, была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, причём управления путём проникновения в «святая святых» живой клетки – в её генетический аппарат.

Современный уровень наших знаний биохимии, молекулярной биологии и генетики позволяет рассчитывать на успешное развитие новой биотехнологии – генной инженерии , т.е. совокупности методов, позволяющих путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии – не воплощение в реальность мифов, а получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые «человеческие» белки.

1. Методы генной инженерии

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (т.е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Большая часть таких препаратов – антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они проникают в бактерии, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга, разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра участка узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты» (их еще называют «липкими» концами).

Весь процесс получения бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1. Рестрикция – разрезание ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигитирование – включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформация – введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом – так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высеивают на питательную среду, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

4. Скрининг – отбор среди клонов тех бактерий, которые несут нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд – это полинуклеотид комплементарной части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном.

Не всегда удается вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой, комплетентарной второй цепи ДНК.

Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Чтобы осуществить перенос генов, необходимо выполнить следующие операции:

·Выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса.

·Создание специальных генетических конструкций, в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида.

·Внедрение генетических конструкций сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы.

2. Достижения генной инженерии

генная инженерия биотехнология наследственность

Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.

Так, в 1980 году гормон роста – соматотропин – получили из бактерии кишечной палочки. До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободными от вирусных загрязнений.

В 1982 году гормон инсулин стали получать в промышленных масштабах из бактерий, содержащих ген человеческого инсулина. До этого времени инсулин выделяли из поджелудочных желез забиваемых коров и свиней, что сложно и дорого.

Интерферон – белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.

В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.

3. Генная инженерия: за и против

Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие «генная инженерия» породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.

Генная инженерия – это мощный способ изменить жизнь, но ее потенциал может представлять опасность, причем в первую очередь надо учитывать сложные и трудно предсказуемые эффекты, связанные с возможным воздействием на окружающую среду. Представьте себе некий яд, более дешевый в производстве, чем сложные гербициды с избирательным действием, но который не может быть использован в агротехнике из-за того, что он убивает полезные растения наравне с сорняками. Теперь представьте, что, допустим, в пшеницу, внедрили ген, делающий ее устойчивой к этому яду. Фермеры, засеявшие свои поля трансгенной пшеницей, могут безнаказанно опылять их смертоносным ядом, увеличивая свои доходы, но нанося непоправимый вред окружающей среде. С другой стороны, генетики могут достичь и противоположного эффекта, если выведут такую культуру, которая не нуждается в гербицидах.

Генная инженерия бросила человечеству уникальный вызов. Что несет нам генная инженерия, счастье или беду? О возможной опасности генетически измененных продуктов для здоровья человека трубит уже весь мир. Однозначного и единого мнения ученых по этому поводу нет. Одни считают, что генная инженерия спасет человечество от голодной смерти, другие – что генетически измененные продукты погубят все живое на земле вместе с человеком. Ученые, занимающиеся этим, утверждают, что генетически измененные растения более урожайны, более устойчивы к ядохимикатам, экономически выгоднее обычных. Поэтому за ними будущее. Однако специалисты, не связанные с производителями данного товара, далеки от оптимизма.

Предугадать отдаленные последствия, которые могут наступить в результате потребления генетически измененной продукции, на данный момент вообще невозможно. Относительно спокойно относятся к ГМ – продуктам (генетически модифицированным) – в США, где выращивается сегодня около 80 процентов всех генетических культур. Европа же относится к этому крайней негативно. Под натиском общественности и организаций потребителей, которые хотят знать, что они едят, в некоторых странах введен мораторий на ввоз таких продуктов (Австрия, Франция, Греция, Великобритания, Люксембург).

В других принято жесткое требование маркировать генетически измененное продовольствие, что, естественно, очень не понравилось поставщикам. 1 июля 2000 года в России была запрещена продажа генетически измененных продуктов без специальной предупредительной надписи на упаковке. Одним из первых ученых, забивших тревогу о потенциальной опасности ГМ – продуктов, был британский профессор Арпад Пуштай. Он назвал их “пищей для зомби”. Такие выводы позволили сделать результаты опытов на крысах, которых кормили генетически модифицированной пищей. У животных возник целый набор серьезных изменений желудочно-кишечного тракта, печени, зоба, селезенки. Наибольшее беспокойство вызвал тот факт, что у крыс уменьшился объем мозга.

Ученые полагают, что с помощью генетически измененных растений можно сократить потери урожая. Сегодня в России завершаются испытания американского картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Возможно, уже в этом году будет получено разрешение на его промышленное производство. Есть у подобных сортов одно существенное “но”. Когда получают растение с резко повышенной устойчивостью к какому-либо вредителю, через два-три поколения этот вредитель приспособится к растению, и будет пожирать его еще сильнее. Следовательно, устойчивый картофель может породить таких агрессивных вредителей, с которыми мир еще не сталкивался.

4. Перспективы генной инженерии

Настоящей находкой для генетиков стал янтарь, ископаемая древесная смола. В доисторические времена в ней часто застывали насекомые, цветочная пыльца, споры грибов, остатки растений. Текучая смола герметично обволакивала своих пленников, и биологический материал в целости и сохранности поджидал современных исследователей. И вот в 1990 году Джордж О. Пойнар из Калифорнийского университета сделал сенсационное открытие. Изучая термитов, попавших в янтарь 40 миллионов лет назад, он нашел хорошо сохранившуюся генетическую информацию. Позднее Пойнару удалось выделить из янтаря ДНК долгоносика, жившего 120 миллионов лет назад! Сейчас многие ученые работают над тем, чтобы воскресить динозавров, древних ящеров, мамонтов. И это уже не кажется фантастикой, как было всего лишь несколько лет назад. Однако ученые не намерены останавливаться на воскрешении животных. Если можно воскресить их, следовательно, то же самое можно проделать и с людьми.

Развитие науки дает нам потенциал как для плохого, так и для хорошего. Поэтому важно, что бы мы сделали правильный выбор. Основная трудность носит политический характер, – это решение вопроса кто есть «мы» в этом предложении. Если оставить этот вопрос на произвол рыночной стихии, скорее всего, пострадают долгосрочные интересы окружающей среды. Но это можно сказать и про многие другие аспекты жизни.

Список использованной литературы

1. Нейман Б.Я. Индустрия микробов. – Знание, 1983.

2. Рувинский А.О. Общая биология. – Просвещение, 1994.

3. Чебышев Н.В. Биология. − Новая волна, 2005.

Энциклопедичный YouTube

1 / 5
Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма . В отличие от традиционной селекции , в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования . Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.
Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии .
Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы , способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы , использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы , термофильные бактерии, способные жить при температуре, как обнаружилось недавно, около 110 °C, и др.
И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.
Другое направление исследований - удаление из ДНК генов, ненужных для кодирования белков и функционирования организмов и создание на основе таких ДНК искусственных организмов с "усеченным набором" генов. Это позволяет резко повысить устойчивость модифицируемых организмов к вирусам .

История развития и достигнутый уровень технологии

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии . Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Фредериком Сенгером и американским учёным Уолтером Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 года). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.
Основные этапы решения генно-инженерной задачи следующие:
1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО ) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию . Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды . Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага , в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.
Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации . В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами . Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.
Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция .
Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование , то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.
Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем . В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR /Cas9 .

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия основана на культивировании растительных и животных клеток и тканей, способных вне организма производить нужные для человека вещества. Этот метод используется для клонального (бесполого) размножения ценных форм растений; для получения гибридных клеток, совмещающих свойства, например, лимфоцитов крови и опухолевых клеток, что позволяет быстро получить антитела.

Генетическая инженерия в России

Отмечается, что после введения государственной регистрации ГМО заметно возросла активность некоторых общественных организаций и отдельных депутатов Государственной думы, пытающихся воспрепятствовать внедрению инновационных биотехнологий в российское сельское хозяйство. Более 350 российских ученых подписали открытое письмо Общества научных работников в поддержку развития генной инженерии в Российской Федерации. В открытом письме отмечается, что запрет ГМО в России нанесёт не только ущерб здоровой конкуренции на рынке сельскохозяйственной продукции, но приведёт к значительному отставанию в сфере технологий производства пищевых продуктов, усилению зависимости от импорта продуктов питания, и подорвет престиж России, как государства, в котором официально заявлен курс на инновационное развитие [значимость факта? ] .

См. также

Примечания
1. Александр Панчин Обыгрывая бога // Популярная механика . - 2017. - № 3. - С. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
2. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system (англ.) . Nature . Проверено 10 января 2017.
3. Элементы - новости науки: Обезьян вылечили от дальтонизма при помощи генной терапии (неопр.) (18 сентября 2009). Проверено 10 января 2017.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетическая инженерия, совокупность методов биохимии и молекулярной генетики, с помощью которых осуществляется направленное комбинированное генетической информации любых организмов.

Генетическая инженерия позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удаленными видами организмов, и создавать клетки и организмы с не существующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами. Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дизоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактически универсальность генетического кода обеспечивает экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии нуклеиновых кислот, выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в т. ч.установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК. Важными предпосылками для появления генетической инженерии явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами, что позволило сформулировать представление о векторах: молекулах - переносчиках генов. Огромное значение в развитии методологии генетической инженерии сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности - сайты - и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусственных структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов. Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

Принципы созд ания рекомбинантных молекул ДНК

Термин «Генетическая инженерия» получил распространение после того, как в 1972 П. Бергом с сотрудниками впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, ее вируса (бактериофага a) и ДНК обезьяньего вируса SV40. В 1973 С. Коэн с сотрудниками использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (EcoRI), которая раскрывает ее в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4 - 6 нуклеотидов). Их называли «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала, по крайней мере, один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в EcoRI-сайт плазмиды. Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основная современная стратегия получения рекДНК сводится к следующему:

1) В ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы, встраивают принадлежащие другому организму фрагменты ДНК, содержащие определенные гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;

2) Образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;

3) Отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению.

Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клетик, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рек ДНК, а следовательно, и копий целевых генов в ее составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определенную рек ДНК. На заключительном этапе производится идентификация клонов, в которых заключен нужный ген. Одна основывается на том, что вставка в рек ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (например, продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа: ни одна из клеток, где происходит клонирование рек ДНК, не должнаполучить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы; последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в генетической инженерии используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетических маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованиям, например, лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплфикацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач генетической инженерии - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т. к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнается РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетический код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т. к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник, из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие, на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделенной интронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетического кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, т. к. состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

Значение генетической инженерии

Генетическая инженерия значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку стало возможным вводить в различные типы клеток чужеродную ДНК и исследовать ее функции. Это позволило выявлять общебиологические закономерности организации и выражения генетической информации в различных организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Многие ранее недоступные биологически активные белки человека, в т. ч. интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови, стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это дало мощный импульс к развитию биотехнологии.

Главными объектами генетической инженерии являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacillus subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cereuisiae, различные линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами генетической инженерии создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов млекопитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм животных и человека рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов различных инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением генетической инженерии является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций. генетический инженерия рекомбинантный молекула

Опасения, связанные с проведением генно-инженерных экспериментов

Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рек ДНК группа ученых во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетическую информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологическое равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того, отмечалось, что вмешательство человека в генетический аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 эти проблемы обсуждались на международной конференции в Асиломаре (США). Ее участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов генетической инженерии, но при обязательном соблюдении определенных правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приемам, обычным в микробиологических исследованиях, созданию специальных защитных устройств, препятствующих распространению биологических агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под генетической инженерией понимают только работу с рек ДНК, а как синонимы генетической инженерии используются термины «молекулярное клонирование», «клонирование ДНК», «клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину «генетическая инженерия». В России как синоним генетической инженерии широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: генетическая инженерия ставит целью создание организмов с новой генетической программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет, как это делается - путем манипуляции с генами.

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы
Лекция№5 Генетическая инженерия.
Генная инженерия . Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.
По своим целям и возможностям в перспективе это направление является стратегическим. Оно позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции при оздоровлении экологической обстановки во всех видах производств.
Важнейшим этапом для развития биотехнологии было выделение в середине текущего столетия молекулярной биологии в самостоятельную дисциплину. Возникновение молекулярной биологии стало возможным благодаря взаимодействию генетики, физики, химии, биологии, математики и др. Э. Чаргофф и З. Д. Хочкис, исследуя молекулярные соотношения нуклеотидных оснований в ДНК (аденин, гуанин, цитозин, тимин) показали, что у различных организмов они одинаковы. Это открытие сыграло ключевую роль в установлении структуры ДНК.
Большую роль в расшифровке структуры ДНК сыграл прогресс в области генетики бактерий и бактериофагов. Было установлено (А. Херши, М. Чейз, Дж. Ледерберг, Н. Циндер), чтотрансдукция (перенос генетического материала) может осуществляться с помощью бактериофага, а фаговой ДНК может принадлежать роль носителя наследственности. Б. Хейсом были выяснены также закономерности полового процесса у бактерий(конъюгация) , при котором из донорских клеток, имеющихF-фактор (фертильность), генетический материал переносится в реципиентные клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили комплиментарную модель строения ДНК и механизм ее репликации; было раскрыто уникальное свойство ДНК – способность самовоспроизведения(репликация).
На базе молекулярной биологии и генетики микроорганизмов к началу 60-х гг. сформировалась молекулярная генетика. Г. Гамов в 1954 году выдвинул гипотезу о том, что каждый кодон (последовательность нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту) должен состоять из трех нуклеотидов. В 1961 году было подтверждено экспериментально, что первичная структура белка закодирована в ДНК в виде последовательности нуклеотидных триплетов (кодонов), каждая из которых соответствует одной из 20 аминокислот. К 1966 году удалось получить данные о строении генетического кода.
Было установлено, что последовательность триплетных кодонов, хранящаяся в ДНК, переписывается в недолговечные молекулы информационной РНК (иРНК). Данный этап ДНК  иРНК был назван транскрипцией , а этап иРНК  белок – трансляцией . Перенос аминокислоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой молекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК) . На ДНК, как на матрице, синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.
Механизм контроля генной активности долгое время оставался неизвестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, показавшие, что у бактерий есть
структурные гены , дающие информацию о синтезе определенных белков
регуляторные гены, которые осуществляют включение или выключение отдельных генов или их блоков.
Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование) , которое дает информацию о первичной структуре участка генома, выполняющего определенные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярно-биологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.
От изучения закономерностей функционирования генетического материала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся во введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или генная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.
В 1972 году Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага dvgal с галактозным оперономE. coli . Инструментом для генетического конструирования стали две группы ферментов –рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы . Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.
Генная инженерия - совокупность методов, позволяющих в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.
ЦЕЛЬ получение клеток, в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки.
1.Плазмиды.
Наиболее распространённым методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных (содержащих чужеродный ген) плазмид, которые представляют собой кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5*10 6 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.
Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Плазмиды несут важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.
Большая часть таких препаратов (антибиотиков) используется в качестве лекарств при лечении заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к антибиотикам, солям тяжёлых металлов. При действии определённого антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь.
Мощным элементом генной инженерии являются открытые в 1974 ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы (ограничение). Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (фаговой) ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определённые последовательности нуклеотидов (сайты – участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называют липкими концами.
Методы генной инженерии.
Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рукомбинантная кольцевоя плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген.
Что такое генетическая инженерия? Генетическая инженерия - это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа прикладной генетической инженерии - теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена.
Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.
В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот.
К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК;
успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты.
изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.
) строение рекомбинатной ДНК
Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий. Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки.
Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования.
Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.
этапы генного синтеза.
Гены, подлежащие клонированию, могут быть получены в составе фрагментов путем механического или рестриктазного дробления тотальной ДНК. Но структурные гены, как правило, приходится либо синтезировать химико-биологическим путем, либо получать в виде ДНК-копии информационных РНК, соответствующих избранному гену. Структурные гены содержат только кодированную запись конечного продукта (белка, РНК), и полностью лишены регуляторных участков. И поэтому не способны функционировать в клетке-хозяине.
При получении рекДНК образуется чаще всего несколько структур, из которых только одна является нужной. Поэтому обязательный этап составляет селекция и молекулярное клонирование рекДНК, введенной путем трансформации в клетку-хозяина. Существует 3 пути селекции рекДНК: генетический, иммунохимический и гибризационный с мечеными ДНК и РНК.
практические результаты генной инженерии.
В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.
На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная “индустрией ДНК”. Это одна из современных ветвей биотехнологии.
Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рек ДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений. Генная инженерия может дать в неограниченном количестве гормоны и другие белки человека, необходимые для лечения генетических болезней (например, инсулин, гормон роста и др.). Усилия генной инженерии направлены на получение бактерий с высокоактивной нитрогеназой, способных в больших количествах связывать и накапливать азот. Еще более интересны попытки биологов включить ген нитрогеназы в растительную клетку. В генной инженерии бактериофаги используются для переноса генетического материала, т. е. В качестве векторов.
Задача генной инженерии – активная и целенаправленная перестройка генов живых существ и их конструирование, т.е. управление наследственностью.
Разработаны методы, позволяющие выращивать организмы из отдельных клеток и тканей.
Благодаря генетической инженерии и слиянию клеток теперь становится возможным производить биотехнологическим методом в промышленных масштабах синтезируемые живыми организмами в ничтожных количествах. Это как уже говорилось интерферон, гормон роста человека или некоторые антитела. Так ген для гормона роста переносят в бактерию таким образом, чтобы она была способна производить его.
Генетика способствует изучению закономерностей развития организма человека и появление его наследственных особенностей в том числе индивидуальных, творческих, физических и интеллектуальных особенностей.
Очевидна роль генетики и в изучении наследственных болезней человека и способов их профилактики, лечения, а так же путем предотвращения вредного воздействия на наследственность физических и химических факторов окружающей среды.
Генноинженерные методы наиболее перспективны в сельском хозяйстве, особенно в растениеводстве. Растения очень удобный объект для генных инженеров.
теоретическое значение генетической инженерии.
За короткий срок генная инженерия оказала огромное влияние на развитие молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться по пути познания строения и функционирования генетического аппарата.
возможности генной инженерии
Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека
В настоящее время фармацевтическая промышленность завоевала лидирующие позиции в мире, что нашло отражение не только в объёмах промышленного производства, но и в финансовых средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг).
Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта, добавок к продукции строительной индустрии и так далее.
Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии,и именно в этих областях интерес к геномным и генно-инженерным исследованиям исключительно высок.
Любой прогресс биотехнологий растений будет зависеть от разработки генетических систем и инструментов, которые позволят более эффективно управлять трансгенами. Для чистого вырезания трансгенного ДНК в растительный геном, всё больше применяют заимствованные из микробной генетики системы гомологичной рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении предварительно подготовленного растительного материала, который уже содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для гомологичного встраивания трансгена. Помимо интегративных систем экспрессии, будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.
Особый интерес представляют искусственные хромосомы растений, которые теоретически не накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации.
Техника генетического конструирования in vitro включает несколько последовательных процедур
Получение нужного гена;
Встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);
Введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;
Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.
Получение генов. Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.
Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые тупые концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие.
Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр.Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК. На слайде показана схема такой машины, сконструированной канадской фирмой «Био лоджикэлс». Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нуклеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполнена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скоростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.
Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощьюобратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК ). Полученнаякомплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованиемДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния. Метод с большим успехом применен для получения в 1979 году гена гормона роста человека (соматотропина).
Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена.
Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК. При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при введении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – реплицироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак, необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устойчивости к антибиотикам.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изолированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расщепляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в линейную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводимой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.
В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны быстро заразить весь организм. Важная проблема при их использовании - аттеньюация (ослабление патогенности для хозяина); поэтому не очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать потомству измененную генетическую программу. Наиболее распространенными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впоследствии их стали конструировать методами генной инженерии.
Использование векторов общего назначения методически – несложная задача, не требующая специального оборудования. Наиболее используемыми плазмидными векторами для клонирования служат плазмиды E. coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), а также сконструированные на основе плазмиды CoIEI. Современные плазмидные векторы в присутствии хлорамфеникола способны к репликации, независимо от деления хромосомы, количество копий плазмид при этом может возрастать до 1–2.10 3 копий на клетку.
Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах, комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli , которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.
Перенос генов в клетки организма-реципиента. Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путемтрансформации иликонъюгации .
Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобретают патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонстрирована и изучена у различных видов бактерий.
Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так называемые компетентные, клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбинантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий.
Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем особых конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информации от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специальные половые ворсинки (пили). Возможна передача информации и с помощью неконъюгативных плазмид при участии плазмид-помощниц.
Скрининг и отбор рекомбинантных клеток. После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь небольшая часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень важный этап - идентификация клеток, несущих ген-мишень.
На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие вектор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости.
На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген-мишень. Для этого используют две группы методов: 1) основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов и 2) основанные на идентификации признака, кодируемого геном-мишенью. При использовании первой группы методов из клеток, предположительно содержащих нужный ген, выделяют векторную ДНК, и в ней проводится поиск участков, несущих данный ген. Далее проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена. Возможен другой метод – гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом (искомый ген или соответствующая ему мРНК); выделенную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с зондом. Далее определяют наличие двуцепочечных гибридных молекул ДНК. Во втором варианте возможен непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени. Применяются также селективные среды, поддерживающие рост только клеток, приобретших ген-мишень.